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    電鏡原位雜交的原理和特點(diǎn)

    點(diǎn)擊次數(shù):1233次  更新時間:2015-07-02

        為了兼顧既保存較好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)又保證較好的雜交反應(yīng)兩者之間的關(guān)系,在電鏡原位雜交中應(yīng)注意以下幾點(diǎn):
     
        1.選擇合適的固定劑  所用固定劑為交聯(lián)固定劑,如甲醛和戊二醛,既能良好保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),又能有效地保存組織細(xì)胞中的核酸,尤其是RNA分子。這類交聯(lián)固定劑,尤其是戊二醛,主要缺點(diǎn)是影響探針對靶核酸的可及性,當(dāng)細(xì)胞中靶核酸序列的拷貝數(shù)很少時,這種影響尤為明顯。所以。一般主張用較低濃度(0.1%一0.5%)的戊二醛或與4%多聚甲醛聯(lián)合使用。在實(shí)驗(yàn)中可試用不同濃度的多聚甲醛和(或)戊二醛,以摸索*濃度。

    鋨酸是電鏡技術(shù)中常用的一種固定劑,但經(jīng)鋨酸固定的組織,RNA的保留較差。在原位雜交技術(shù)中,標(biāo)本在原位雜交反應(yīng)后再用鋨酸進(jìn)行后固定似乎不影響標(biāo)記信號,這樣有利于膜結(jié)構(gòu)的保存,可增加細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的電子密度反差。

    選擇合適的探針  放射性和非放射性探針都可用于電鏡原位雜交。與光鏡原位雜交反應(yīng)一樣,用放射性核素標(biāo)記的探針做電鏡原位雜交,其敏感性較高,標(biāo)記物不干擾雜交反應(yīng),并且結(jié)果適于進(jìn)行定量分析。常用的放射性核素為3H、35S、125I和32P。3H的β射線能量zui低。雜交信號能得到*的亞細(xì)胞定位,但放射自顯影的曝光時間較長。35S的β射線能量較高,故其亞細(xì)胞定位不如’H,但放射自顯影時間較短,實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)用zui廣。應(yīng)用非放射性標(biāo)記探針進(jìn)行電鏡原位雜交不需長時間進(jìn)行放射自顯影,又可避免放射性核素的污染問題,而且其分辨率即雜交信號的亞細(xì)胞定位要比放射性核素標(biāo)記探針好。在電鏡原位雜交中用得zui多的非放射性標(biāo)記物是生物素。雜交體上的生物素可用HRP或膠體金標(biāo)記的抗生物素抗體、A蛋白或卵白素來檢測。
    如果用強(qiáng)交聯(lián)劑固定,應(yīng)選擇較短序列的探針,使探針易于滲透,提高雜交反應(yīng)效率。
     
        3.適宜的雜交前處理  雜交前處理中應(yīng)盡量避免蛋白 酶消化,去污劑Triton X-100的濃度也應(yīng)降低,以不高于o.02%為宜。因醋酸酐處理能破壞細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu),故應(yīng)避免。
     
        4.適宜的檢測方法  電鏡原位雜交的雜交信號必須具有高電子密度,只有這樣才能在電鏡下識別。
        放射性核素標(biāo)記探針電鏡原位雜交的雜交體用放射自顯影術(shù)檢測。電鏡放射自顯影要求分辨率*,與光鏡放射自顯影相比,于電鏡放射自顯影的核乳膠的銀粒較細(xì),一般要求銀粒直徑在1.6X10―;m以下。制備電鏡自顯影標(biāo)本時,要求乳膠層薄到只有一層溴化銀晶體的厚度,稱為單層乳膠。在單層乳膠中,溴化銀晶體彼此接近,既不互相重疊,又不留有無溴化銀晶體的空隙。當(dāng)超微結(jié)構(gòu)中體積極小的放射源的核射線穿透單層乳膠時,只使距放射源zui近的銀粒曝光。而射線不作用于其他的銀晶體上,不至造成影像彌漫泛化。


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